m6米乐官网app登录.人类微生物组编码抗糖尿病药物阿卡波糖的耐药性

　　在本研究中，我们使用基于宏基因组学的搜索策略，发现人类肠道和口腔微生物组的细菌成员编码酶，这些酶选择性地磷酸化临床使用的抗糖尿病药物阿卡波糖，导致其失活。使用生化分析、X射线晶体学和宏基因组分析，我们表明微生物组衍生的阿卡波糖激酶对阿卡波糖具有特异性，为其保护生物体提供对抗阿卡波糖活性的保护优势，并且广泛存在于西方和非西方人群的微生物组中。这些结果提供了一个微生物群对非抗生素药物普遍耐药的例子，并表明阿卡波糖耐药性已在人类微生物群中传播，并作为对抗密切相关分子的潜在内源性生产者的防御策略。

　　阿卡波糖是从土壤细菌放线中发现并在工业上生产的。在生物合成基因簇（BGC）内编码一种用于阿卡波糖（acb）生产的自我抗性机制；一种特定的激酶AcbK在O6A羟基处磷酸化阿卡波糖，使其失去活性（图1a）。从概念上讲，任何编码相同功能的细菌都会对阿卡波糖产生类似的抗性。因此，我们使用两种方法在人类微生物组中计算搜索编码AcbK同源物的基因：（1）在NCBI和人类微生物组项目（HMP-1-1）组装的宏基因组支架上对细菌分离物的基因组进行BLAST搜索；（2）使用MetaBGC对来自五个不同队列（HMP，包括HMP-1-1和HMP-1-2，MetaHIT，Chinese和Fijicomp）的3212个人类微生物组样本的未装配宏基因组测序数据进行搜索。综合起来，我们的搜索确定了82个基因（其中70个全长），被指定为微生物组编码的碳水化合物激酶（mck1–mck82）（方法，补充表1和2以及扩展数据图1）。

　　接下来，我们测试了计算确定的Mcks是否确实可以磷酸化和灭活阿卡波糖。我们构建了70个全长Mcks的系统发育树，其中包括来自土壤细菌的三种已知磷酸化阿卡波糖的蛋白质（AcbK、GacK和ScatK），以及充分表征的来自大肠杆菌的ATP依赖性6-磷酸果糖激酶（PfkB )。系统发育树显示了一个包含21个Mcks的大型进化枝，它们与三个阳性对照（AcbK 进化枝）聚集在一起（图1b和扩展数据图2）。我们合成了9个mck基因的密码子优化DNA序列（8个来自AcbK分支的不同亚类，1个来自外部分支），以及阳性对照AcbK，用于在大肠杆菌中表达重组蛋白。在成功表达和纯化后，我们将得到的蛋白质与ATP和阿卡波糖一起孵育，并使用高效液相色谱与质谱联用 (HPLC-MS) 定量阿卡波糖和磷酸化阿卡波糖的反应后水平（扩展数据图3和补充图1）。我们计算了9种蛋白质中每一种观察到的反应速率（kobs），并将它们归一化为AcbK的kobs（我们计算为0.034 s-1；补充表3）。来自AcbK进化枝的8种测试蛋白质的kobs比AcbK慢17倍到快2倍（图1c）。只有来自AcbK进化枝之外的Mck23的kobs比AcbK的kobs慢300倍以上。因此，我们指定了来自AcbK进化枝微生物组衍生的阿卡波糖激酶 (Maks) 的所有8种测试蛋白质，还指定了来自该进化枝推定的Maks(pMaks)的未经测试的蛋白质（图1b）。接下来，使用MetaBGC（方法），我们检测了来自所有主要身体部位（肠道、口腔、皮肤和）和五个国家（美国、中国、丹麦、西班牙和斐济）的3212份样本中mak和pmak基因的表达。值得注意的是，13个mak和pmak基因在口腔样本中最为普遍（249/264，占HMP参与者的94%，144/243，占斐济参与者的59%，在其口腔样本中编码至少一个mak或pmak基因），尤其是在龈上菌斑样本中（229/230，占HMP参与者的99%）。个体口腔mak和pmak基因的流行率差异很大（口腔样本中HMP参与者的8%至81%），其中mak1分布最广（213/264，81%的HMP参与者）且最丰富（图1d、扩展数据图4和补充表2）。从分离的基因组中发现的口腔mak和pmak基因由放线菌门（如放线菌）、厚壁菌门（如Solobacterium moorei）和梭杆菌门（如Leptotrichia trevisanii）中的多种细菌编码，根据宏基因组数据确定的mak和pmak基因预计来自相同的3个门（图1b和补充表1）。

　　虽然在肠道微生物组中偶尔可以检测到几种口服mak和pmak基因，但只有一种基因——mak16，由肠道血厚壁菌编码，仅在肠道中发现（25/301，占HMP参与者的8%；7/194，占中国人的4%；21/193，占Fijicomp的11%；34/318，占MetaHit的11%）。最后，我们分析了几个公开的转录组数据集，并检测到至少两个不同个体的口腔微生物组样本中12个mak和pmak基因与粪便微生物组样本中一个基因（mak16）匹配的转录组读数（方法和补充表2）。综上所述，这些结果表明阿卡波糖失活酶的同系物广泛存在于不同人群的口腔和肠道微生物群中。

　　图1. 从人类微生物组中发现Maks的宏基因组学。a，阿卡波糖BGC（acb）（顶部）。底部，AcbK磷酸化阿卡波糖以产生阿卡波糖-O6A-磷酸盐。b，本研究中发现的AcbK同源物的最大似然系统发育树，使用MEGA7构建（参考文献42），在分支点显示的1000个重复中，引导值50%。该树包括先前表征的阿卡波糖激酶（红色）、来自大肠杆菌的PfkB、经实验验证的Mck具有（绿色、Maks）或缺乏（蓝色）阿卡波糖-O6A-激酶活性，以及未经实验测试的（黑色），以及未经实验测试的（黑色）。PMAK表示AcbK分支中假定的MAK。起源细菌的门用阴影框表示。星号表示该门是由于宏基因组起源而被预测的。完整的树如扩展数据图2所示。c，每个实验表征的Mck/Mak相对于AcbK的速率，如b中所示。单个重复的值（n = 2或n = 3） 显示为小圆圈。原始数据见补充表3。扩展数据图3和5中显示了代表性的HPLC–MS和HPLC高分辨率（HR）–MS/MS数据。d，热图显示了五个分析队列中mak和pmak基因的选定子集的丰度，这是由MetaBGC计算的（未显示无映射读取的样本）（顶部）。使用UPGMA（具有算术平均值的未加权配对组方法）在R. Bottom的pheatmap中进行分层聚类，在HMP队列中两个身体部位的同一组mak和pmak基因的患病率（阳性个体的百分比）。所有队列中所有mck基因的患病率和丰度如扩展数据图2和补充表2所示。2 Mak1和AcbK的相似酶动力学

　　我们进一步表征了最丰富和分布最广的Mak，Mak1。首先，我们测试了Mak1对阿卡波糖的磷酸化是否会导致其失活，正如AcbK报道的那样。我们使用比色法测定了AcbK或Mak1产生的阿卡波糖及其磷酸化形式对人唾液淀粉酶和猪胰腺淀粉酶的抑制活性（扩展数据图5）。虽然阿卡波糖在浓度为10μM时能完全抑制这两种酶，在相同浓度下（图2a、b和补充表4），两种磷酸化形式（由AcbK或Mak1产生）均未观察到抑制作用。这些结果证实了Maks对阿卡波糖的磷酸化导致其失活。其次，我们测试了阿卡波糖是否是Mak1的首选底物；已知碳水化合物激酶磷酸化结构相似的底物。我们将Mak1和AcbK与8种不同的碳水化合物和氨基糖苷一起孵育，并计算它们与每种底物的观察反应速率。Mak1和AcbK均表现出对阿卡波糖的强烈偏好，而对相关化合物几乎没有磷酸化作用（扩展数据图6）。

　　最后，我们还测试了Mak1磷酸化阿卡波糖的酶动力学是否与AcbK的酶动力学相似。我们确定阿卡波糖的表观米氏常数（Km）对于Mak1为 424 μM，对于AcbK为428 μM（图2c和补充表3），表明阿卡波糖作为底物也有类似的偏好。值得注意的是，Mak1的kcat（多重转化催化速率常数）为16.4 s−1，而 AcbK 为 8.2s-1，表明在类似的实验室条件下，Mak1磷酸化阿卡波糖的速度比AcbK快。在不同的底物浓度（图2c和扩展数据图6）和温度（扩展数据图6和补充表3）下，一致观察到这种差异。此外，在固定的ATP和阿卡波糖浓度下，酶浓度增加100倍会导致AcbK的kobs线的kobs非线是一种协同酶（Hill系数） = 1.71 ± 0.06），而AcbK不是（Hill = 1.13 ± 0.02）（扩展数据图6和补充表3）。这些结果表明，Mak1和AcbK在底物选择性、催化活性和Km方面非常相似，但在kcat和协同性方面略有不同。

　　图2. Mak1和AcbK以相似的酶动力学磷酸化和灭活阿卡波糖。a，b：猪胰腺淀粉酶（a）和人唾液淀粉酶（b）的比色淀粉酶活性测定。405处吸光度的增加 nm（y轴，每30分钟测量一次 s） 表明寡糖底物模拟物（亚乙基) -pNP-G7) 和显色染料 (p-硝基苯酚) 作为淀粉酶活性的直接寡核苷酸的释放。尽管任一淀粉酶与10 μM阿卡波糖完全消除其活性，与Mak1或AcbK产生的相同浓度的阿卡波糖-O6A-磷酸（Acb-O6A-P）孵育不再具有抑制作用。a和b中绘制的数据来自单个实验。补充表4给出了本实验和第二次重复实验的原始数据，显示了相同的结果。c.AcbK（灰色）和Mak1（蓝色）的Michaelis–Menten饱和曲线。Km和kcat值以各自的颜色表示，两种酶的单独kobs测量重复在图上显示。S0为初始底物浓度，E0为酶浓度。原始数据见补充表3。

　　为了了解这两种激酶是如何识别和磷酸化阿卡波糖的，我们通过X射线 Å的分辨率测定了与阿卡波糖和非水解ATP类似物腺苷酸亚氨基二磷酸（AMP-PNP）结合的AcbK的晶体结构和分辨率为3.1 Å的等效Mak1络合物 Å（补充表5）。Mak1和AcbK结构相似（均方根偏差 = 1.12 Å代表272个Cα原子），具有42%的序列同一性，与大肠杆菌核糖激酶PfkB（蛋白质数据库（PDB）：1RKD）具有相同的整体折叠。这种核糖激酶的单体由两个结构域组成：一个核心α/β结构域和一个朝向N-末端的较小的五链β-折叠（图3a）。AcbK和Mak1通过五链β-片的二聚作用在晶体中形成同型二聚体，形成“β-扣环”，其包含Mak1中的残基13-41和93-113，以及AcbK中的残基14-42和94-115（图3b和扩展数据图7）。β-环扣内多肽链之间的相互作用广泛，高达1298个 Å2的表面积，形成一个小的疏水核。β-环扣内的每个β-片包含来自二聚体中两个单体的β-链，尤其是一个单体的β3与另一个单体的β8（图3b和扩展数据图7）。β-卡环还形成阿卡波糖结合位点的一面，来自一个单体的β3与同型二聚体中另一个单体的活性位点的边缘接触，形成阿卡波糖结合位点上盖子的一部分（图3b和扩展数据图7）。相反，由AMP-PNP占据的ATP结合位点完全包含在每个单体中。

　　阿卡波糖底物在β-环和α/β结构域之间形成的核糖激酶折叠裂缝内以延伸构象结合。每个阿卡波糖分子可埋藏多达501Å2的一个单体表面积和94 Å2在每个二聚体中的另一个单体上。阿卡波糖的阿卡维菌素部分（A和B环；图1a）不同于相关低聚糖，并在阿卡波糖和激酶之间产生最广泛的相互作用。A环上的每个羟基与AcbK:Ser109上的残基形成氢键，与阿卡波糖O2A形成氢键；含O3A的Asn99；Asp16与O4A；以及带有O6A的Asp248（扩展数据图7）；Mak1中分别有Ser108、Asn98、Asp15和Asp247（图3c）。这些氢键残基在所有测试和确认的MAK中都是保守的，可能对稳定阿卡波糖A环很重要（图3d和扩展数据图7）。阿卡波糖B环和激酶之间的相互作用涉及两个氢键：阿卡波糖O2B与AcbK中的Asn165和Ser31（Mak1中的Asn163和Ser30），并由二聚体中的两个单体贡献，环夹在芳香侧链的表面之间：AcbK中的Trp111和His164，或Mak1中的Tyr110和His162。与环A和环B相反，环A和环B牢牢地固定在活性位点裂口的最深部分，环C和环D位于裂口的较浅区域，与蛋白质缺乏氢键（图3c和扩展数据图7）；因。